สารพันธุกรรม อธิบายเกี่ยวกับการปนเปื้อนเพื่อแยกผลบวกที่ผิดพลาด

สารพันธุกรรม จำเป็นต้องใช้ถุงมือสะอาด หลอดทดลองแบบใช้แล้วทิ้งและทิปสำหรับปิเปตอัตโนมัติ เพื่อดำเนินการบำบัดรังสีอัลตราไวโอเลตเบื้องต้นในห้อง และพื้นผิวการทำงานของโต๊ะและอุปกรณ์ เราเน้นย้ำว่าเมทริกซ์ดีเอ็นเอของยีนของเซลล์ ไวรัสและแบคทีเรียนั้นเหมาะสำหรับการตรวจหาสารพันธุกรรมมานานหลายทศวรรษ แม้กระทั่งหลังจากการแช่แข็ง การอบแห้ง อุณหภูมิหรือการทำให้โปรตีนเสื่อมสภาพทางเคมี

ความไวของการตรวจหาสารพันธุกรรมบางครั้งถึงขีดจำกัด ที่เป็นไปได้ทางคณิตศาสตร์ การตรวจจับ 1 สำเนาของแม่แบบสารพันธุกรรม ดังนั้นจึงมีความเสี่ยงสูงที่จะได้ผลลัพธ์ที่เป็นเท็จ เนื่องจากการถ่ายโอนผ่านวัตถุและรีเอเจนต์ของเมทริกซ์ สารพันธุกรรมทั้งคู่น้อยกว่า และแอมพลิคอนบ่อยครั้งมากที่ได้รับในปริมาณมากในหลอดทดลองจำนวนมาก ในระหว่างการทำงานประจำวัน สาเหตุของผลบวกลวง ได้แก่ การปนเปื้อนต่อไปนี้ การปนเปื้อนจากตัวหนึ่งไปยังอีกตัว

ระหว่างการประมวลผลของตัวอย่างทางคลินิก หรือเมื่อทิ้งส่วนผสมของปฏิกิริยา ทำให้เกิดผลบวกที่ผิดพลาดเป็นระยะๆ การปนเปื้อนด้วยพลาสมิดรีคอมบิแนนท์ที่มีลำดับการโคลนนิ่งของยีนที่จะตรวจพบ การปนเปื้อนด้วยเครื่องขยายสัญญาณ เป็นสาเหตุที่พบบ่อยที่สุดของผลบวกที่ผิดพลาด เนื่องจากในระหว่างการวินิจฉัยยีน การตรวจหา สารพันธุกรรม แอมพลิคอนจะสะสมในปริมาณมากและสามารถถ่ายโอน ด้วยละอองลอยและผ่านอุปกรณ์ต่างๆได้ง่ายมาก

ดังนั้นการตรวจหาผลิตภัณฑ์ การตรวจหาสารพันธุกรรม ควรดำเนินการในห้องแยกโดยที่ไม่ได้ดำเนินการ ตัวอย่างทางคลินิกและไม่เตรียมรีเอเจนต์ การตรวจหาสารพันธุกรรม การเตรียมสารละลายสต็อคควรทำในห้องปลอดเชื้อแยกต่างหาก ควรจัดเก็บ และใช้สารละลายทั้งหมดในส่วนเล็กๆ จำเป็นต้องดำเนินการควบคุมในห้องปฏิบัติการประเภทต่างๆอย่างต่อเนื่อง และใช้การควบคุมแบบเข้ารหัสเชิงลบและเชิงบวกเป็นระยะๆ เพื่อประเมินความจำเพาะและความไวของการศึกษา

การตรวจหาสารพันธุกรรม โดยการปฏิบัติตามข้อกำหนดเหล่านี้อย่างต่อเนื่อง และดำเนินการควบคุมเชิงลบประเภทต่างๆ ในแต่ละการตรวจหาสารพันธุกรรม สำหรับขั้นตอนการถอดรหัสย้อนกลับ สารละลายบัฟเฟอร์ ไพรเมอร์ ผลลัพธ์การตรวจหาสารพันธุกรรมที่เป็นบวกเท็จสามารถขจัดออกไปได้ในทางปฏิบัติ การเลือกวิธีการควบคุมมีความสำคัญมาก สำหรับการตีความผลลัพธ์ที่ถูกต้อง การควบคุมเชิงบวกและเชิงลบควรมีลักษณะเฉพาะที่ดี

มักใช้สารพันธุกรรมจากสายเซลล์ ที่ทราบว่ามีหรือไม่มีลำดับเป้าหมาย การทดสอบแต่ละครั้งต้องการการควบคุมอย่างน้อยสามอย่าง การควบคุมเชิงบวกทราบว่าตัวอย่างมีลำดับเป้าหมาย การควบคุมเชิงลบตัวอย่างไม่มีลำดับเป้าหมายอย่างชัดเจน การควบคุมว่างเปล่าส่วนผสมของปฏิกิริยา ซึ่งมีส่วนประกอบทั้งหมดยกเว้นสารพันธุกรรม ส่วนควบคุมว่างเปล่าเป็นตัวบ่งชี้การปนเปื้อน การควบคุมเชิงบวกประเภทหนึ่งควรมีจำนวนลำดับเป้าหมายสูงสุด

อีกประเภทหนึ่งจำนวนเล็กน้อย ซึ่งช่วยให้คุณกำหนดความไว รวมถึงประสิทธิภาพของการตรวจหาสารพันธุกรรมได้ การตรวจจับสำหรับการวิเคราะห์สารพันธุกรรม ที่ขยายด้วยการตรวจหาสารพันธุกรรม มีวิธีการที่แตกต่างกัน เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส การผสมแบบดอทบลอตและไฮบริไดเซชั่นบลท์ สามารถใช้ในการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ การตรวจหาสารพันธุกรรมส่วนใหญ่ได้ แต่ผลลัพธ์ที่แม่นยำอย่างยิ่งจะได้มาจากการจัดลำดับเท่านั้น

ควรสังเกตว่าในบทต่อไปนี้ จะมีการอธิบายการดัดแปลง การตรวจหาสารพันธุกรรม ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์ซึ่งการตรวจจับการเพิ่มขึ้น ของปริมาณของผลิตภัณฑ์ การตรวจหาสารพันธุกรรม ซึ่งจะดำเนินการโดยตรงในหลอดทดลองระหว่างปฏิกิริยา การมีอยู่ของผลิตภัณฑ์ การตรวจหาสารพันธุกรรมจำเพาะ ในกรณีส่วนใหญ่ตรวจพบโดยการแยกอิเล็กโตรโฟเรติก ของส่วนผสมการขยายสัญญาณ การตรวจหาสารพันธุกรรมบนเจลอะกาโรเซ่

พอลิอะคริลาไมด์ที่ย้อมด้วยเอทิเดียมโบรไมด์ การตรวจจับนี้ต้องการสารพันธุกรรม อย่างน้อย 20 นาโนกรัม ความจำเพาะของแถบ สารพันธุกรรมที่ขยายนั้นได้รับการยืนยัน โดยตำแหน่งที่สัมพันธ์กับชิ้นส่วนเครื่องหมาย และมาตรฐานสารพันธุกรรม หลักฐานเพิ่มเติมสำหรับความจำเพาะของแอมพลิคอน ได้มาจากการตัดแยกด้วยเอนไซม์จำกัดจำเพาะ อะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสทำให้การตรวจหา สารพันธุกรรมที่ถูกขยายและกำหนดขนาดของสารพันธุกรรม

ซึ่งเป็นเรื่องง่ายโดยไม่ต้องใช้ไอโซโทปรังสี ให้เราอาศัยคุณลักษณะบางอย่างที่เกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์ สารพันธุกรรมที่ขยายด้วยการตรวจหาสารพันธุกรรม 10 ถึง 20 ไมโครลิตรของสารพันธุกรรม ที่ถูกขยายจะถูกแยกในเจลอะกาโรเซ่ 2 เปอร์เซ็น พร้อมกับชิ้นส่วนมาตรฐาน 50 ถึง 1000 คู่เบส อิเล็กโตรโฟรีซิสดำเนินการที่แรงดันสูง เนื่องจากชิ้นส่วนขนาดเล็กที่เกิดขึ้นระหว่างการตรวจหาสารพันธุกรรม นั้นยากต่อการตรวจจับหลังจากอิเล็กโตรโฟรีซิสที่แรงดันไฟฟ้าต่ำ

เนื่องจากการแพร่ที่รุนแรง สามารถปรับปรุงความละเอียดได้โดยใช้โพลีอะคริลาไมด์ หรือเจลอากาโรสที่มีความเข้มข้นสูงของอากาโรส 3 ถึง 4 เปอร์เซ็น อย่างไรก็ตาม หากต้องวิเคราะห์อย่างรวดเร็วและมีค่าใช้จ่ายต่ำ เจลอากาโรส 2 เปอร์เซ็นก็ถือว่ายอมรับได้ โดยปกติเมื่อขยายสารพันธุกรรมที่แยกได้จากเนื้อเยื่อตายตัว ผลผลิตของผลิตภัณฑ์ การตรวจหาสารพันธุกรรมจะต่ำกว่าและมีความเฉพาะเจาะจงน้อยกว่า เมื่อขยายสารพันธุกรรมที่มีความบริสุทธิ์สูง

วิธีการผสมพันธุ์ด้วยการตรวจหาสารพันธุกรรมขยาย สารพันธุกรรมการผสมเทียมทำให้สามารถระบุแถบในเจลที่สังเกตได้ หลังจากอิเล็กโตรโฟรีซิสของสารพันธุกรรมที่ขยายแล้ว ใช้โพรบทั้งแบบไอโซโทปและไม่ติดฉลากสำหรับไฮบริไดเซชัน การผสมแบบรอยจุดให้คำตอบง่ายๆ และมีประโยชน์อย่างยิ่งเมื่อวิเคราะห์ตัวอย่างจำนวนมาก การหาลำดับโดยตรงของสารพันธุกรรมที่ขยายแล้ว ยังเป็นวิธีการที่มีความน่าเชื่อถือสูงในการพิสูจน์ความจำเพาะ

แต่ส่วนใหญ่จะใช้เพื่อกำหนดจุดกลายพันธุ์ในยีน ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาสำหรับการตรวจจับ และการหาปริมาณของสารพันธุกรรมที่ขยายพร้อมกันนั้น วิธีการไฮบริไดเซชันเอนไซม์บนไมโครเพลทได้ถูกนำมาใช้มากขึ้น แต่มีตัวเลือกอื่นๆ ใช้โพรบโอลิโกนิวคลีโอไทด์มีฉลากดิจอกซิเจนินหรือฟลูออเรสซีน ตามด้วยการพัฒนาโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อ ดิจอกซิเจนินหรือฟลูออเรสซีน โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ติดฉลากด้วยเอนไซม์กับสารพันธุกรรมที่มีเกลียวคู่

โพรบที่ติดฉลากรูทีเนียม วิธีอิเล็กโทรเคมีลูมิเนสเซนต์มีแนวโน้มมากสำหรับการตรวจจับเชิงปริมาณ ของแอมพลิคอนบนเจลอิเล็กโตรโฟเรแกรมเป็นกล้องวิดีโอขนาดเล็ก ผลลัพธ์การตรวจหาสารพันธุกรรม สามารถกำหนดเป็นค่าบวกหรือค่าลบได้ ขึ้นอยู่กับว่าพบลำดับเป้าหมายที่น่าสนใจในตัวอย่างที่หรือไม่ อย่างไรก็ตาม การหยุดชะงักของขั้นตอนปกติของการขยายเสียง ความไวของวิธีการไม่เพียงพอ และความหลากหลายที่ไม่คาดคิดของลำดับเป้าหมาย

ในบริเวณที่มีผลผูกพันไพรเมอร์ หรือโพรบไฮบริไดเซชันในบางครั้งทำให้เกิดผลลบเท็จ ตัวอย่างที่ปนเปื้อนและความคล้ายคลึงแบบสุ่มระหว่างโพรบ ไพรเมอร์และลำดับที่คล้ายกับเป้าหมาย ส่งผลให้เกิดผลลัพธ์ที่เป็นเท็จ การปรับเปลี่ยนในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมามีการใช้เทคนิคง่ายๆ เช่น การตรวจหาสารพันธุกรรมอย่างแพร่หลาย ซึ่งประกอบด้วยหลอดอุ่นล่วงหน้าที่มีส่วนผสมของการขยาย การตรวจหาสารพันธุกรรมที่อุณหภูมิ 95 องศาเศลเซียสเป็นเวลา 3 ถึง 5 นาที

เทคนิคนี้ช่วยป้องกันการขยายชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ไม่เฉพาะเจาะจง เนื่องจากการจับคู่สีรองพื้นแบบไม่จำเพาะในอุณหภูมิต่ำ เมื่อใช้ RNA เป็นเทมเพลตสำหรับ การตรวจหาสารพันธุกรรมสารพันธุกรรมเสริม cDNA จะถูกสังเคราะห์บนเทมเพลต RNA นี้โดยใช้เอนไซม์ สารพันธุกรรมพอลิเมอเรส

บทความที่น่าสนใจ : แว่นตาตกปลา การเลือกแว่นตาที่ทำมาจากวัสดุที่มีคุณภาพสูง